Soutenances de thèse
QIAO Qin
Effets reprotoxiques des microcystines et des métabolites secondaires produits par les cyanobacteries du genre Microcystis chez le poisson médaka adulte
Doctorat sous la direction de Cécile BERNARD et Benjamin MARIE
Soutenance le 16 decembre 2016 à 14h au MUSEUM (63 rue buffon,,salle des collections) devant le jury composé de :
- WIEGAND Claudia, Professeur (Rapporteur)
- FESSARD Valérie, Directeur de Recherche (Rapporteur)
- LUDEK Bláha, Professeur (Examinateur)
- ZHANG Xuezhen , Professeur (Examinateur)
- BERNARD Cécile, Professeur (Directrice de thèse)
- MARIE Benjamin, Chargé de Recherche (Co-directeur de thèse)
Summary:
The study was conducted to investigate the potential reproductive toxicity of MC-LR and the mixture of secondary metabolites produced by MC-producing Microcystis in adult medaka fish with one acute and one chronic investigation. An investigation of the metabolic specificities of the liver in two genders of medaka fish was performed in prior to the cyanotoxin exposure.
The metabolic specificities of the liver in adult medaka fish were investigated by using histological, metabolomic, proteomic and transcriptomic approaches, which attested to a strong sexual dimorphism that concerned various cellular and molecular processes of hepatocytes. The histological observation clearly showed differences of reserve vesicle within hepatocytes between female (large isolated reserve vesicles) and male (more diffuse small vesicle) fish. Metabolomic investigation detected and quantified 237 potential metabolites in the medaka liver. Fifty-nine metabolites are over-represented in females, and 103 appear to be over-represented in males. Female-enriched metabolomes are implicated in some saccharide and amino acid metabolic processes, whereas male-enriched metabolomes exhibit signatures of steroid hormone biosynthesis and energy (TCA, nitrogen) processes, when the common metabolite set is more relevant to other amino acid and saccharide metabolism. Proteomic analysis identified and quantified 1241 proteins in the medaka liver. Twenty-five and one hundred twenty-five proteins are significantly over-represented in males and females, respectively ( | FC | >3 and p <0.01). Female-biased proteins are significantly related to tRNA and nucleotide sugar metabolism, whereas male-biased proteins are related to bile and amino acid metabolisms, and common proteins to other TCA, sugar, lipid and amino acid metabolisms. Transcriptomic study revealed 375 and 147 significantly enriched transcripts in females and males, respectively (|FC|>4 and p <0.001). The strong sex-biases of transcripts testify to the intensity of the female liver efforts for the gene expression and the synthesis of the oocyte precursor proteins, and the involvement of the male liver in steroid hormone and metabolism processes.
In the acute investigation, adult medaka fish were administered with 10 µg.g -1 bw of pure MC-LR for 1 hour by gavage. The histological examination and immunolocalization of the MC-treated fish liver revealed a severe liver lesion along with an intense distribution of MC-LR in the liver, being particularly localized in the cytoplasm and nucleus of hepatocytes. In the goand of MC-treated fish, MC-LR was shown to be present in the connective tissue of ovary and testis. Additionally, immunogold electron microscopy, for the first time, revealed that MC-LR was also localized in the chorion, cytoplasm and yolk vesicles of oocytes.
In the chronic study, adult medaka fish were chronically exposed to 1 and 5 µg.L -1 microcystin-LR (MC-LR) and to the extract of MC-producing Microcystis aeruginosa PCC 7820 (5 µg.L -1 of equivalent MC-LR) by balneation for 28 days. The results revealed that both MC-LR and the Microcystis extract exert adverse effects on reproductive parameters including fecundity and egg hatchability. The main cause of the observed reproduction impairment is believed to be the overall liver dysfunction induced by MC-containing treatments, rather than their directly deleterious effects on gonad. The histological observation indicated that hepatocytes of female fish under toxin treatments present noticeable glycogen storage loss along with severe cellular damages. The quantitative proteomics analysis revealed that the quantities of 225 hepatic proteins are dysregulated under the three toxic treatments. In particular, a notable decrease in protein quantities of vitellogenin and choriogenin was observed, which could explain the decrease in reproductive output. In addition, our toxin treatments do not induce any characteristic estrogenic effects. Liver transcriptome analysis through Illumina RNA-seq reveals that over 100 to 400 genes are differentially expressed under 5 µg.L -1 MC-LR and Microcystis extract treatments, respectively. Ingenuity pathway analysis of the omics data attests that various metabolic pathways, such as energy production, protein biosynthesis and lipid metabolism, are disturbed by both MC-LR and the Microcystis extract, which could be provoking the observed reproductive impairment. The transcriptomics analysis also constitutes the first report of the impairment of hepatic circadian-rhythm-related genes induced by MCs. This study contributes to a better understanding of the potential consequences of chronic exposure of fish to environmental concentrations of cyanotoxins, suggesting that Microcystis extract could impact a wider range of biological pathways, compared with pure MC-LR, and even 1µg.L -1 MC-LR potentially induces a health risk for aquatic organisms.
Soutenances de thèse
LE MANACH Séverine
Diversité des métabolites secondaires produits par les cyanobactéries et leurs effets écotoxicologiques chez le poisson médaka
Doctorat sous la direction de Benjamin MARIE et Séverine ZIRAH
Soutenance le 06 decembre 2016 à 14h au MUSEUM (Amphi rouelle) devant le jury composé de :
- BERNARD Cécile, Professeur (Président)
- MARIE Benjamin, Chargé de Recherche (Directeur de thèse)
- ZIRAH Séverine, Maître de Conférence (Directeur de thèse)
- HEGARET Hélène, Chargé de Recherche (Rapporteur)
- GONZALEZ Patrice, Chargé de Recherche (Rapporteur)
- VASCONCELOS Vitor, Professeur (Examinateur)
- VINH Joëlle, Directeur de Recherche (Examinateur)
- GEFFARD Olivier, Chargé de Recherche (Examinateur)
Résumé :
Depuis plusieurs décennies, les évènements d’efflorescences de cyanobactéries n’ont cessé d’augmenter en raison de l’eutrophisation exacerbée des milieux aquatiques et des changements climatiques globaux. Dans les eaux douces, le genre Microcystis est le plus fréquemment rencontré lors des épisodes d’efflorescences de cyanobactéries. Elles sont capables de produire une grande diversité de métabolites secondaires potentiellement toxiques, y compris les microcystines (MCs) qui sont les cyanotoxines les plus souvent rencontrées. Dans ce contexte, les travaux de ma thèse se sont intéressés à la diversité chimique associée aux cyanobactéries du genre Microcystis ainsi qu’à l’étude de leurs effets écotoxicologiques sur le poisson modèle médaka (Oryzias latipes).
Les objectifs principaux ont été traités d’une part à travers l’élaboration d’une base de données via une étude bibliographique, comprenant environ 700 métabolites secondaires produits par les cyanobactéries d’eaux douces et par une approche globale de comparaison de la diversité chimique de 24 souches de cyanobactéries du genre Microcystis. D’autre part, compte tenu de la complexité associée aux organismes étudiés, nous avons dans un premier temps évalué le potentiel toxique d’extraits complexes de cyanobactéries aux chemotypes distincts vis à vis du poisson médaka de façon chronique (28 jours). Ensuite, les poissons ont été exposés à des cultures de clones de Microcystis producteurs ou non producteurs de MCs durant 21 jours en microcosmes et durant 4 jours en mésocosmes.
Les résultats acquis décrivent une grande diversité de composés principalement oligopeptidiques potentiellement bioactifs produits par le genre Microcystis. D’une façon générale on a pu observer des réponses distinctes entre les femelles et mâles médaka exposés aux différents traitements de cyanobactéries.
Les extraits contenants des MCs ont induits des dommages hépatocellulaires conséquents et les analyses de protéomiques et métabolomiques ont mis en évidence des dérégulations de protéines impliquées notamment dans la régulation de l’homéostasie et divers processus métaboliques. Nos résultats des expositions aux cellules vivantes montrent que les clones producteurs mais également non producteurs de MCs induisent des dommages hépatocellulaires et la dérégulation de voies moléculaires principalement impliquées dans la production d’énergie, la régulation de l’homéostasie et le métabolisme des stéroïdes.
Par la combinaison d’approches « omiques » et histopathologiques, ce travail de thèse montre pour la première fois d’importants disfonctionnements du métabolisme hépatique associés à une toxicité cellulaire issu de l’exposition à divers clones de Microcystis. Ces résultats suggèrent également que l’exposition à des cyanobactéries dans l’environnement puisse à terme être responsable de perturbations de la reproduction de certaines espèces de poissons. Par ailleurs, ces résultats mettent en avant que des métabolites délétères autres que les MCs sont produits par les cyanobactéries et qu’il est important dans l’évaluation des risques environnementaux de prendre en considération la complexité métabolique des cyanobactéries plutôt que l’effet d’une seule cyanotoxine.
Abstract :
Over the past few decades, massive cyanobacterial blooms have been increasing due to the interactive effects of eutrophication and climate change. In freshwater, the cyanobacterium Microcystis is an important bloom-forming and toxin producing genus. Microcystis is known to produce a large proportion of secondary metabolites potentially toxic, comprising the well known microcystin cyanotoxins (MCs) that have attracted more attention due to their worldwide distribution. In this general context, my thesis focuses on the diversity of Microcystis natural products and their ecotoxicological effects on medaka fish (Oryzias latipes).
The main objectives were on the one hand investigated through the establishment of a database of above 700 secondary metabolites produced by freshwater cyanobacteria and a global comparison of the chemical diversity of 24 Microcystis strains. On the other hand, given the complexity related to the organisms, we initially assessed the toxic potential of complex cyanobacterial extracts exhibiting various chemotypes on medaka fish chronically exposed (28 days). Then medaka fish were exposed to MCs-producing and non-MCproducing living strains for 21 days in microcosms and for 4 days in mesocosms.
Our results described a high diversity of potentially bioactive compounds which are mainly oligopeptide classes produced by Microcystis genus. Overall, sex-dependent responses were observed after all cyanobacterial treatments. Complex extract containing MCs induced clear hepatocellular damages and both proteomics and metabolomics analyses highlighted differential expression of proteins involved in the regulation of homeostasis and various other metabolic processes. Our results of the living strains exposure revealed that both non-MC and MC-producing strains were able to induce hepatocellular damages and dysregulations of molecular pathways involved in energy production, regulation of homeostasis and steroids metabolism.
Altogether, this combination of histological and molecular approaches exhibit the cellular impairments associated with clear biological disruptions in the liver as a result of Microcystis exposures. In addition these results suggest that, in natural environment, cyanobacterial exposition may ultimately impact the reproduction process of some species. Furthermore, these results highlight that deleterious metabolites, other than MCs, are produced by cyanobacteria such as Microcystis and the importance of considering cyanobacterial cells as a whole to assess the realistic environmental risk of cyanobacteria on fish.
Soutenances de thèse
GHANMI Fadoua
Production, purification et caractérisation de peptides antimicrobiens d’archées halophiles isolées de la saline de Sfax
Doctorat sous la direction de Sylvie Rebuffat et Sami Maalej et co-encadré par Alyssa Carré-Mlouka.
Thèse en co-tutelle avec l’Université de Sfax (Tunisie)
Soutenance le 1er décembre 2016 au MUSEUM (salle des collection, 63 rue Buffon) devant le jury composé de :
- BOUSSETTA Hamadi, Professeur (Rapporteur)
- DRIDER Djamel, Professeur (Rapporteur)
- MAALEJ Sami, Professeur (Directeur de thèse)
- REBUFFAT Sylvie, Professeur (Directeur de thèse)
- CARRE-MLOUKA Alyssa, Maître de conférences (invité)
- MAJDOUB Hafedh, Professeur (invité)
- PEDUZZI Jean, Chargé de recherche CNRS (invité)
Résumé :
La saline de Sfax est un milieu hypersalin localisé dans la zone centrale de la côte est de Tunisie. Dans ce travail, nous avons isolé, identifié, et caractérisé des souches halophiles produisant des peptides antimicrobiens (halocines), afin de mieux comprendre leur rôle dans les interactions microbiennes au sein des milieux hypersalins. Deux étangs salins (TS18, 390 g.L-1 NaCl et M1, 200 g.L-1 NaCl) ont été choisis pour l’échantillonnage. Trente-cinq souches de procaryotes halophiles ont été isolées et caractérisées, dont 11 ont présenté une activité antimicrobienne. Parmi ces souches, 3 produisent des substances antimicrobiennes de nature protéique. A l’aide de PCR et RT-PCR nous avons montré que les souches Halobacterium salinarum ETD5 et ETD8 exprimaient le gène de l’halocine S8, un peptide de 3,6 kDa préalablement purifié d’une souche S8a non identifiée. Le peptide a été purifié à partir de cultures de la souche Hbt. salinarum ETD5. Après purification bioguidée, les fractions actives révèlent deux bandes de 8 et 14 kDa présentant une activité antimicrobienne. L’analyse par séquençage Nterminal et spectrométrie de masse a permis d’identifier ces deux halocines. La bande de 8 kDa correspond à une halocine S8 de 81 acides aminés qui subirait une maturation post-traductionnelle protéolytique différente de celle initialement décrite dans la littérature. Le clonage et le séquençage du gène codant le précurseur de l’halocine S8 démontrent que la séquence est identique chez les deux souches ETD5 et S8a. La bande de 14 kDa correspond à une nouvelle halocine, l’halocine S14. L’halocine S14 correspond à une forme tronquée en partie N-terminale de la Mn-superoxyde dismutase (SOD) d’Hbt. salinarum. Il pourrait s’agir d’évolution divergente d’un gène codant deux protéines distinctes, ou d’une maturation différente de la SOD. Ce travail permettra de mieux connaître les molécules intervenant dans les interactions microbiennes dans les milieux hypersalins, des milieux extrêmes susceptibles de révéler des structures et des modes d’action originaux.
Soutenances de thèse
MAEVAERE Jimmy
Les peptides lasso des actinobactéries : diversité chimique et rôle écologique
Doctorat sous la direction de Séverine Zirah et co-encadré par Yanyan Li.
Soutenance le 14 novembre 2016 au MUSEUM (salle des collection, 63 rue buffon) devant le jury composé de :
- MONNET Véronique, Directeur de recherche (Rapporteur)
- PERNODET Jean-Luc, Directeur de recherche (Rapporteur)
- CAMADRO Jean-Michel, Directeur de recherche (Examinateur)
- SUZUKI Marcelino T., Professeur (Examinateur)
- ZOTCHEV Sergey B., Professeur (Examinateur)
- ZIRAH Séverine, Maître de conférence (Directrice de thèse)
- Li Yanyan, Chargée de recherche (Co-directrice de thèse)
Résumé :
Les peptides lasso sont des peptides bioactifs bactériens issus de la voie de biosynthèse ribosomale et subissant des modifications post-traductionnelles, caractérisés par une structure entrelacée dite en lasso. Ils possèdent un cycle macrolactame en position N-terminale, traversé par la queue C-terminale. Cette topologie de type rotaxane, maintenue par piégeage de la queue C-terminale dans le cycle via des acides aminés encombrant et/ou des ponts disulfure, confère à ces peptides une structure compacte et stable. Les actinobactéries recèlent la plus grande diversité et gamme d’activités biologiques parmi les peptides lasso (antibactériens, anti-VIH, antagonistes de récepteurs..), et l’exploration de génomes suggère une diversité encore plus grande, puisque certains clusters portent des gènes codant des enzymes de modifications post-traductionnelles jamais observées auparavant. Cependant, l’expression de ces peptides semble être rigoureusement contrôlée, rendant leur production en laboratoire difficile à partir de la bactérie productrice. Le rôle écologique et les mécanismes de régulation des peptides lasso ne sont pas très documentés. Leur compréhension permettrait d’améliorer la production et de mieux exploiter les activités biologiques des peptides lasso.
La première partie de mon travail de thèse porte sur la découverte de nouveaux peptides lasso chez les actinobactéries par expression des clusters de gènes correspondant dans un hôte hétérologue de Streptomyces. Pour cela, un système d’expression basé sur une voie de régulation impliquant une protéine SARP (Streptomycesantibiotic regulatory protein) a été développé. L’analyse de génomes d’une collection d’actinobactéries, en particulier d’un ensemble de souches isolées d’éponges, nous a permis de sélectionner six clusters qui ont été exprimés selon cette stratégie. Cette approche a permis la production de trois peptides lasso dotés de nouvelles caractéristiques, identifiés par spectrométrie de masse.
La seconde partie de mon travail de thèse porte sur le mécanisme de régulation et le rôle écologique des peptides lasso en prenant la svicéucine, produite par Streptomyces sviceus, comme modèle d’étude. La génération de souches inactivées pour la production de svicéucine a permis de révéler que l’expression de la svicéucine est contrôlée par un système de régulation codé à proximité des gènes de biosynthèse. La caractérisation de ces souches mutantes a révélé une sensibilité accrue à de fortes concentrations de KCl et également, de façon spécifique, à un générateur d’ion superoxyde, la phénazine methosulfate. Ces éléments suggèrent que la svicéucine pourrait jouer un rôle dans la résistance aux stress osmotique et oxydatif au cours du cycle de vie de S. sviceus.
Soutenances de thèse
BESSE Alison
Interactions microbiennes et adaptations en milieu extrême : peptides antimicrobiens d’archées halophiles
Doctorat sous la direction de Sylvie Rebuffat et co-encadré par Alyssa Carré-Mlouka.
Soutenance le 23 septembre 2016 au MUSEUM (salle des collection, 63 rue Buffon) devant le jury composé de :
- DUFOUR Alain , Professeur (Président)
- REBUFFAT Sylvie, Professeur (Directeur de thèse)
- CARRE-MLOUKA Alyssa, Maître de conférences, (co-Directeur de thèse)
- HUGUET Arnaud, Chargé de recherche (Rapporteur)
- JEBBAR Mohamed, Professeur (Rapporteur)
Résumé :
Les archées halophiles sont des procaryotes vivant dans des conditions d’extrême salinité. Ces micro-organismes colonisent les environnements hypersalins et synthétisent des peptides antimicrobiens appelés halocines, qui pourraient leur conférer un avantage sélectif sur leurs compétiteurs. Parmi les peptides antimicrobiens d’archées halophiles décrits, on distingue l’halocine C8, initialement purifiée à partir de la souche halophile Natrinema sp. AS7092. Ce travail de thèse a permis de montrer que la production d’halocine C8 était conservée chez plusieurs archées halophiles appartenant aux genres : Natrinema, Haloterrigena, Haloferax et Halobacterium. Une activité antimicrobienne associée des particules supérieures à 100 kDa non infectieuses, suggèrent que l’halocine C8 est synthétisée dans des vésicules. Ce travail présente des résultats qui déboucheront sur une meilleure compréhension des compétitions microbiennes dans les environnements hypersalins et du rôle écologique des halocines.
Soutenances de thèse
LECOINTRE Agathe
Scleractinian coral morphogenesis : searching for stem cells and precursors of the skeletogenic calicodermis.
Doctorat sous la direction de Domart-Coulon, I. et Meibom, A.
thèse de l’Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne
Soutenance le 30 août 2016 à l’école polytechnique de Lausanne devant le jury composé de :
- BATTIN T.I, Professeur (Président)
- DOMART-COULON Isabelle, Maître de Conférence (Directeur de thèse)
- MEIBOM A., Professeur (Directeur de thèse)
- FINE M., Professeur (Rapporteur)
- HOULISTON E. Professeur (Rapporteur)
- BERNIER-LATMANI R., Professeur (Rapporteur)
Résumé :
La métamorphose est une étape cruciale du cycle de vie des coraux scléractiniaires : la larve planctonique, la planula, se fixe au substrat et se métamorphose en un polype primaire sessile qui donnera la colonie adulte. Cette morphogenèse en polype primaire implique la mise en place de la couche cellulaire formant le squelette, appelée calicoderme, mais les mécanismes cellulaires sous-jacent ne sont pas bien compris. Dans la présente étude la mise en place du calicoderme a été étudiée chez deux espèces de coraux, Pocillopora damicornis et Stylophora pistillata, en évaluant la prolifération cellulaire et l’apoptose ainsi que par l’utilisation de méthodes de microscopies électroniques, d’outils de biologie moléculaire et d’imagerie isotopique par NanoSIMS. La prolifération cellulaire pendant la métamorphose du corail a été évaluée par incubation en présence de BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) durant 24 h. De plus, au stade polype primaire, la migration des cellules marquées a été suivi sur plusieurs jours (48 à 64 h) après le pulse initial. Plusieurs observations ont été faites :
1) Au stade précoce de la métamorphose, pendant lequel débute la formation du squelette et donc qui requière un calicoderme fonctionnel, le taux de prolifération des cellules dans ce tissu n’est pas significativement plus élevé que dans le stade précédent, la planula. Cela indique que la mise en place du calicoderme se fait via transdifférentiation des cellules de l’épithélium pseudostratifié aboral de la planula en cellules du calicoderme.
2) Plus tard, dans le polype primaire en croissance, le taux de division des cellules reste bas dans le calicoderme ce qui indique que les cellules qui le composent ne proviennent pas directement du calicoderme.
3) Au même stade, le pharynx du polype primaire présente le taux de prolifération cellulaire le plus élevé avec 19% de ses cellules marquées au BrdU. Ces cellules migrent ensuite du pharynx jusqu’au calicoderme en passant par l’épithélium pseudostratifié et/ou les filaments mésentériaux.
4) De façon à identifier de potentielles cellules souches ainsi que le lieu de la différentiation des cellules en cellules du calicoderme, des marqueurs biologiques ont été développés. Des cellules souches potentielles exprimant le gène piwi ont été localisées dans les mésentères et sous le bulbe des tentacules de P. damicornis. Ces zones correspondent à des sites de prolifération et sont associées respectivement avec la gamétogenèse et la nématogenèse.
5) Pdcyst-rich est une protéine spécifique du calicoderme des polypes adultes et est potentiellement impliquée dans la formation du squelette. Le gène associé s’exprime au stade précoce de la métamorphose, au moment où le squelette commence à se former. Les résultats préliminaires indiquent que la protéine est aussi présente lors de la formation du polype primaire ainsi que dans le squelette du polype primaire. Cela suggère un rôle de Pdcyst-rich dans la squelletogenèse, potentiellement en tant que protéine de la matrice organique du squelette ou que protéine d’adhésion au squelette.
Mots-clés : Scleractinia – métamorphose – calicoderme – prolifération cellulaire – cellules souches
Soutenances de thèse
SOUIDENNE Dhikra
Parasites chromidinés et dicyémides des sacs rénaux de céphalopodes : évaluation de leur biodiversité morphologique et moléculaire
Doctorat sous la codirection d’Isabelle FLORENT et de Mohamed S. ROMDHAME (INAT, Tunis)
Thèse en cotutelle de l’Université de Carthage et de l’ED 227, MNHN, Discipline Ecologie et Evolution, soutenue le 28 avril 2016 à Paris, MNHN (Amphi Rouelle)
Jury
- Dr. Isabelle ARZUL, IFREMER, Laboratoire de Génétique et Pathologie, La Tremblade (Rapporteur)
- Pr. M’Hamed EL CAFSI, Faculté des Sciences Mathématiques Physiques et Naturelles de Tunis (Rapporteur)
- Pr. Angel GUERRA, Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC), Vigo, Espagne (Examinateur)
- Dr. Nicolas PUILLANDRE, MC, ISYEB - UMR7205, MNHN (Examinateur)
- Pr. Mohamed S. ROMDHAME, Institut National Agronomique de Tunisie, Université de Carthage (Directeur de thèse)
- Pr. Isabelle FLORENT, MCAM UMR 7245 CNRS-MNHN, MNHN (Directeur de thèse)
Résumé
Les sacs rénaux des céphalopodes sont communément le siège d’infections parasitaires spectaculaires provoquées principalement par des ciliés apostomes du genre Chromidina et des mésozoaires, les dicyémides. Les formes végétatives sont vermiformes et peuvent atteindre plusieurs mm de long. Elles sont fixées par leur partie antérieure aux cellules rénales. La diversité de ces parasites énigmatiques, basée sur des morpho-espèces, reste très mal connue pour les chromidinés et aucune donnée moléculaire n’est disponible pour ces ciliés. Les Dicyémides ont été en revanche plus étudiés mais les données morphologiques et moléculaires sont parcellaires et leurs relations phylogénétiques restent débattues.
Au cours de cette thèse, nous nous sommes proposés d’étudier ces deux groupes afin d’évaluer leur biodiversité chez les céphalopodes méditerranéens et d’Atlantique, et de fournir plus d’éléments pour la compréhension de leur systématique et de leur phylogénie. Ainsi, à partir d’un large d’échantillonnage de céphalopodes d’Atlantique (Concarneau, France) et méditerranéens (La Goulette, Tunisie) prélevés sur 3 années consécutives, nous avons entrepris de caractériser morphologiquement et génétiquement ces parasites en réalisant une analyse moléculaire du marqueur ADNr 18S afin d’aborder la notion d’espèce, de préciser leur spécificité d’hôte, de corréler la diversité morphologique et génétique, et de mesurer la variabilité génétique au sein d’une même morpho-espèce.
Dans nos échantillonnages, la prévalence de l’infection par des chromidinés s’est révélée faible, certainement biaisée par les milieux échantillonnés, essentiellement benthiques, alors que les chromidinés infectent préférentiellement les céphalopodes pélagiques. Nous pouvons cependant prédire que leur biodiversité est sous-estimée, car deux nouvelles espèces ont pu néanmoins être décrites. Nous avons pu obtenir pour la première fois des séquences de l’ADNr 18S de ces parasites. Les analyses phylogénétiques robustes montrent que les chromidinés se positionnent parmi les ciliés apostomes au sein de la classe des Oligohymenophorea, avec comme groupe frère les pseudocollinidés.
La prévalence des dicyémides était beaucoup plus importante (88%). Un problème important dans la systématique des dicyémides est que bon nombre de morpho-espèces nommées sont basées sur des descriptions morphologiques incomplètes qui entrainent des ambiguïtés dans leur détermination. Ceci nous a amenés à redécrire de façon détaillée sur tous les stades de développement l’espèce Dicyemennea eledones rencontrée dans nos échantillonnages. Les analyses phylogénétiques des séquences du marqueur ADNr 18S obtenues au cours de cette études et intégrant les séquences de dicyémides déjà connues, nous ont permis de définir 10 clades robustes. Les morpho-espèces ne se distribuent pas de façon non ambigüe au sein de ces clades puisque certaines morpho-espèces se retrouvent dans plusieurs clades et que certains clades peuvent regrouper plusieurs morpho-espèces. Ceci pose la question de la pertinence de ce marqueur ADNr 18S pour l’identification des espèces, voire même des genres, et pose également, la question de la pertinence des marqueurs morphologiques utilisés à ce jour pour la systématique des dicyémides.
Soutenances de thèse
ECHENIQUE Isidora
Mieux comprendre les conditions de développement et la biodiversité microbienne des biofilms en rivières pour mieux les surveiller - Cas particulier des biofilms à Cyanobactéries
Doctorat sous la direction de Catherine QUIBLIER et Jean-François HUMBERT
Soutenance le 19 avril 2016 à 14h au MUSEUM (Amphi rouelle) devant le jury composé de :
- LAUGA Beatrice, Professeur (Rapporteur)
- LOPEZ-GARCIA Purificación, Directeur de Recherche (Rapporteur)
- BELOIN Christophe, Directeur de Recherche (Examinateur)
- PERONA Elvira, Professeur (Examinateur)
- SEZONOV Guennadi, Professeur (Président)
- HUMBERT Jean-François, Directeur de Recherche (Directeur de thèse)
- QUIBLIER Catherine, Maître de conférences (Co-directrice de thèse)
Résumé :
Dans un contexte général de dégradation de nombreux écosystèmes aquatiques, les travaux de ma thèse se sont intéressés à la problématique des proliférations de cyanobactéries benthiques potentiellement toxiques qui peuvent former des biofilms épais sur le fond de certaines rivières. Alors que les proliférations de cyanobactéries planctoniques ont fait l’objet de nombreuses études, notamment en raison de leurs effets néfastes sur les écosystèmes et des limitations de leurs usages qu’elles provoquent, seul un nombre très restreint de travaux s’est intéressé aux proliférations de cyanobactéries benthiques. Partant de ce constat, les données acquises au cours de cette thèse se sont inscrits à la fois dans une démarche fondamentale d’acquisition de connaissances sur la composition microbienne et l’écologie des biofilms périphytiques, avec un regard particulier sur les proliférations de cyanobactéries benthiques en rivières, et dans une démarche plus appliquée sur les stratégies et outils pour la surveillance des biofilms à cyanobactéries dans les rivières afin de répondre à une demande des Agences de l’Eau et des gestionnaires de milieux aquatiques. Ces travaux ont reposé sur des prélèvements de biofilms dans deux rivières Françaises, le Tarn et la Loue, et dans neuf rivières Néo-Zélandaises. Les communautés microbiennes au sein des biofilms ont été caractérisées par des approches de séquençage à haut débit ciblant un fragment du gène de la petite sous-unité de l’ARN ribosomal 16S et 18S. Des données environnementales permettant de décrire le contexte dans lequel les biofilms se sont développés ont été également acquises.
Les résultats principaux permettant une amélioration des connaissances sur les communautés microbiennes et l’écologie des biofilms de rivières se rapportent à la mise en évidence (i) de l’importance fondamentale de certains facteurs comme la température de l’eau sur l’évolution saisonnière de l’ensemble des communautés périphytiques et de la nécessité de prendre en compte les contextes hydrologique et géologique des stations de prélèvements pour comprendre ces variations, (ii) par l’analyse des corrélations entre les OTU dominantes des communautés phototrophes et hétérotrophes, d’interactions positives entre certaines de ces OTU, par exemple dans le cadre du recyclage de la matière organique ou d’interactions négatives, par exemple dans le cas des compétitions pour l’accès à la lumière entre bactéries et micro-algues phototrophes et (iii) d’une structuration géographique des communautés bactériennes associées aux biofilms à cyanobactéries qui semble plus s’expliquer par le contexte environnemental local des biofilms que par leur éloignement par la distance. Concernant les données acquises lors de cette thèse pour améliorer la surveillance et la gestion des risques liés aux proliférations de cyanobactéries benthiques, nos travaux ont permis de montrer les limites d’un nouvel outil (sonde spectrofluorimétrique) pour la détection et la quantification des cyanobactéries benthiques et de proposer des stratégies d’échantillonnage pour évaluer l’importance des biofilms à cyanobactéries en rivières. Finalement, nos résultats suggèrent que la prévention des risques liés aux cyanobactéries benthiques potentiellement toxiques devrait essentiellement reposer sur l’information des usagers.
Summary :
In a general context of aquatic ecosystems degradation, my thesis focuses on the issue of potentially toxic benthic cyanobacterial proliferations that can form thick biofilms fixed on the riverbed of certain rivers. While planktonic cyanobacterial blooms have been the subject of numerous studies, mainly due to their detrimental effects on the ecosystems and the limitations of their use that they can cause, only a limited number of works have focused on benthic cyanobacterial proliferations. Therefore, the data acquired during this thesis involves, a fundamental approach for knowledge acquisition on microbial composition and periphytic biofilms ecology, with a particular interest on benthic cyanobacterial proliferations and an applied approach concerning strategies and tools for the monitoring of cyanobacterial biofilms on rivers in order to meet a request from water agencies and aquatic environmental managers. These works have relied on biofilm samples collected at two French Rivers, the Tarn and the Loue, and at nine New Zealand Rivers. The microbial communities within biofilms have been characterised by Next-Generation-Sequencing approaches targeting a fragment of the 16S and 18S small-subunit ribosomal RNA gene. Environmental data, which allowed describe the context in which biofilms develop, was also acquired.
The main results concerning the improvement on the knowledge of microbial communities and the ecology of river biofilms highlighted (i) the fundamental importance of certain factors such as water temperature on the seasonal evolution of all periphytic communities and the need to take into account the hydrological and geological context of sampling stations to understand these variations, (ii) the analysis of correlation between dominant OTU from phototrophic and heterotrophic communities showed positive interactions among certain of these OTU, for example on the framework of organic matter recycling and also showed negative interactions, in the case of light access competition between phototrophic bacteria and microalgae, and (iii) a geographical structure of microbial communities associated to cyanobacterial biofilms that seems to be mostly explained by local environmental context rather than distance per se . Regarding data acquisition aimed at improving monitoring and risk management of benthic cyanobacterial proliferations, our work showed the limitations of a new tool (spectrofluorometric probe) for the detection and quantification of benthic cyanobacteria and to propose sampling strategies to evaluate the importance of cyanobacterial biofilms in rivers. Finally, our results suggest that risk prevention linked to benthic cyanobacteria potentially toxic should essentially be based on providing information to users.
Soutenances de thèse
ALLAIN Thibault
Rôle des Bile Salt Hydrolases (BSH) des lactobacilles dans le contrôle de la Giardiose
Doctorat sous la codirection d’Isabelle FLORENT et de Luis BERMUDEZ (INRA Micalis)
Thèse de Doctorat de l’Institut des Sciences et Industries du Vivant et de l’Environnement (AgroParisTech), Spécialité : microbiologie, soutenue le 22 mars 2016 à Jouy-en-Josas (Institut Micalis, INRA)
Jury
- Dr. Jean-Pierre GRILL, Maître de Conférences, UPMC (Rapporteu)
- Dr. Eric VISCOGLIOSI, Directeur de Recherche, Institut Pasteur de Lille (Rapporteur)
- Pr. André BURET, Professeur, University of Calgary (Examinateur)
- Dr. Yves LE LOIR, Directeur de Recherche, INRA Agrocampus Ouest (Examinateur)
- Dr. Luis BERMUDEZ, Directeur de Recherche, INRA Jouy-en-Josas (Directeur de thèse)
- Pr. Isabelle FLORENT, Professeur, Muséum National d’Histoire Naturelle (Co-Directrice de thèse)
- M. Armel GUYONVARCH, Professeur, Université Paris-Sud (Examinateur)
- M. Bruno POLACK, Maitre de Conférences, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort (Invité)
Résumé :
Giardia duodenalis est le protozoaire responsable de la giardiose, la parasitose intestinale la plus répandue dans le monde. Cette infection se caractérise par une malabsorption intestinale, des diarrhées, une perte de poids et des douleurs abdominales intenses chez l’Homme et de nombreux mammifères. Par ailleurs, cette maladie dont l’impact en santé publique et vétérinaire est reconnu, peut entraîner d’importantes déficiences nutritionnelles en particulier chez les sujets jeunes. L’infection est causée par l’ingestion de kystes de Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) présents dans les aliments ou l’eau contaminée. Infectieux à très faibles doses, ces kystes survivent pendant plusieurs semaines dans l’environnement et sont résistants aux différents désinfectants. Suite au dékystement, la forme végétative de Giardia, le trophozoïte, adhère à l’épithélium intestinal au niveau des parties supérieures de l’intestin grêle et se multiplie, causant les symptômes. Cette phase se termine par un nouvel enkystement et l’excrétion de kystes par les fèces. Le nombre croissant d’infections liées à la contamination de l’eau potable, à l’émergence de souches résistantes aux médicaments disponibles, à la fréquence des échecs thérapeutiques et à l’importance des effets secondaires associés aux traitements font de cette maladie un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs.
Il est désormais bien établi que le microbiote et/ou certaines souches de bactéries probiotiques ont un impact bénéfique dans la giardiose. En particulier, la bactérie probiotique Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) a un rôle protecteur contre la croissance de Giardia in vitro et in vivo. Nous avons cherché dans ce travail de Thèse à décrypter les mécanismes moléculaires associés à l’effet inhibiteur des facteurs sécrétés par LjLa1. Nous avons montré qu’in vitro, LjLa1 agissait en libérant des enzymes de type Bile Salt Hydrolases (BSH) qui modifient alors des composants de la bile non-toxiques pour le parasite (sels biliaires conjugués) en des composants toxiques (sels biliaires déconjugués). Les 3 gènes BSH codés dans le génome de LjLa1 ont été clonés chez Escherichia coli et les protéines taguées histidine purifiées pour étudier leurs propriétés biochimiques et biologiques. Obtenues sous forme active, nous avons pu en définir les spécificités de substrats et montrer qu’elles sont capables d’inhiber significativement la croissance de G. duodenalis in vitro et in vivo, dans un modèle murin de la giardiose (souriceaux OF1 non sevrés). En parallèle, nous avons identifié, à l’issue d’un large criblage de souches de lactobacilles selon leur activité anti-Giardia in vitro, une souche probiotique aux effets inhibiteurs comparables à ceux de LjLa1 : Lactobacillus gasseri CNCM-4884. Administrée in vivo dans le modèle murin de la giardiose, cette souche a réduit de 93% la charge parasitaire dans l'intestin grêle des nouveaux nés et a également réduit de façon significative le nombre de kystes libérés dans l’environnement, permettant ainsi de réduire la transmission de Giardia. Des travaux parallèles ont été réalisés au cours de ce projet de Thèse, notamment le développement d’outils de moléculaire pour l’expression hétérologue de molécules d’intérêt en santé animale chez divers lactobacilles. Le développement de ces « vecteurs mucosaux » permettra à terme de proposer une stratégie de surexpression de BSH par les lactobacilles afin d’accroitre l’activité BSH in vivo, et renforcer ainsi l’élimination du parasite.
Ces résultats permettent de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques originales contre les giardioses humaines et animales, basées sur l’utilisation de lactobacilles probiotiques ou sur les activités BSH qui en sont dérivées. Ces traitements offrent alors une alternative sérieuse aux antibiotiques et permettront de pallier aux actuels fréquents échecs thérapeutiques.
